淋巴細胞的表面標(biāo)志物
日期：2023-11-28 09:24:15
淋巴細胞是最小的白細胞，是淋巴器官產(chǎn)生的一種免疫識別細胞系。根據(jù)它們的遷移、表面標(biāo)志物和生物功能，淋巴細胞可以分為三類：T淋巴細胞（T細胞）、B淋巴細胞（B細胞）和自然殺傷細胞（NK細胞）。這三個亞群在免疫中發(fā)揮不同的作用：T淋巴細胞引發(fā)細胞介導(dǎo)的免疫，B淋巴細胞主要負責(zé)體液免疫，NK細胞介導(dǎo)先天免疫。
圖1. 淋巴細胞亞群
1. 為什么要鑒定不同的淋巴細胞亞群？
淋巴細胞亞群的平衡維持著機體正常的免疫功能。淋巴細胞亞群數(shù)量和功能的異常變化會導(dǎo)致一系列病理變化和免疫功能紊亂，從而導(dǎo)致疾病的發(fā)生。研究表明，淋巴細胞亞群在腫瘤形成 [1] [2]、傳染病 [3] [4]、器官移植 [5] [6]、自身免疫性疾病、糖尿病等過程中起著重要作用。因此，臨床上淋巴細胞亞群的鑒定和監(jiān)測具有重要意義。
2. 如何鑒定不同的淋巴細胞亞群？
三種類型的淋巴細胞在形態(tài)上基本相似，需要通過表面標(biāo)志物檢測來區(qū)分不同的亞群。淋巴細胞表面標(biāo)志物根據(jù)淋巴細胞類型和分化階段而異。
3. 什么是細胞表面標(biāo)志物？
細胞表面標(biāo)志物是嵌入在細胞膜脂雙層結(jié)構(gòu)中的膜蛋白，通常包括膜抗原、膜受體和其他分子。淋巴細胞與周圍環(huán)境中的其他細胞和分子之間的相互作用，以及在抗原中淋巴細胞的生物效應(yīng)，包括識別、激活、輔助、抑制和殺傷，都與它們的表面標(biāo)志物有關(guān)。利用細胞表面標(biāo)志物來區(qū)分T淋巴細胞和B淋巴細胞極大地推動了免疫現(xiàn)象的細胞基礎(chǔ)分析 [7]。
淋巴細胞表面標(biāo)志物的檢測在基礎(chǔ)和臨床免疫學(xué)研究以及患者免疫功能測定中得到廣泛應(yīng)用。淋巴細胞表面標(biāo)志物通常分為三大類：表面免疫球蛋白（SIg）、分化抗原（或特異性抗原）和膜受體。CD（分化簇）分子是最常用的細胞表面標(biāo)志物之一。
4. T淋巴細胞及其細胞表面標(biāo)志物
4.1 T淋巴細胞
T細胞是特異性抗原的淋巴細胞，源自造血組織并在胸腺中成熟。它們得名于此——胸腺依賴性淋巴細胞。T細胞可以分為輔助T細胞（Th）、細胞毒性T細胞（Tc）和調(diào)節(jié)性T細胞（Treg）。Th/Tc比例的改變會改變機體的免疫功能 [8]。當(dāng)受到抗原刺激時，T淋巴細胞會轉(zhuǎn)化為淋巴母細胞，然后分化為致敏的T淋巴細胞，參與細胞免疫。它主要抵御細胞內(nèi)感染、腫瘤細胞和同種異體細胞。
NKT淋巴細胞是具有NK細胞特性的T淋巴細胞亞群 [9]，它們既具有T淋巴細胞的抗腫瘤免疫活性，又具有NK細胞的非MHC限制性抗腫瘤特性 [10]。它們在抗感染、抗腫瘤、自身免疫平衡調(diào)節(jié)等方面起著重要作用[11]。
4.2 T淋巴細胞細胞表面標(biāo)志物
在T淋巴細胞中，輔助T細胞可以進一步分為Th0、Th1、Th2、Th3（TGF-β）、Th17（IL17）等。
通過相對特異的CD抗原標(biāo)記可以區(qū)分Th1和Th2：
Th1---CD3 +CD4+CD30-
Th2---CD3+CD4+CD30+
研究表明，Th1具有明顯的細胞毒性效應(yīng)，主要分泌細胞因子如IL2、IFN-γ或TNF-β，以協(xié)助細胞免疫或參與遲發(fā)型超敏反應(yīng)。Th1細胞表面標(biāo)志物還包括IL-12β2R [12] 和IL-18R [13]。Th2沒有細胞毒性效應(yīng)，主要分泌細胞因子如IL4、IL5、IL6或IL10，以協(xié)助體液免疫，并參與快速型超敏反應(yīng)。
研究發(fā)現(xiàn) [14]，Th1/Th2不平衡紊亂與多種疾病過程有關(guān)，如腫瘤免疫、移植免疫和過敏。
在T淋巴細胞中，細胞毒性T細胞（Tc）還可以進一步分為：
Tc1（IFN-γ）和Tc2（IL-4、IL5、IL-10）。
區(qū)分Tc1和Tc2的相對特異的CD抗原標(biāo)記：
Tc1---CD3+CD8+CD30-
Tc2---CD3+CD8+CD30+
以下表格是T淋巴細胞的細胞表面標(biāo)志物。
表1. 主要CD抗原及其在T細胞表面的分布
| CD抗原 | 分布 |
|---|---|
| CD2（ER） | 所有的T細胞和NK細胞 |
| CD3 | 成熟T細胞 |
| CD4（HIVR） | Th 細胞 |
| CD8 | Tc細胞，部分NK細胞 |
| CD25（IL-2R） | 活化T細胞 |
| CD28 | T 細胞 |
| CTLA-4 | 活化T細胞 |
| CD40L | 活化T細胞 |
4.2.1 CD2
CD2，又稱為LFA2，是一種黏附分子，能與綿羊紅細胞（SRBC）結(jié)合，也被稱為綿羊紅細胞受體（E受體）。它的配體是LAF3。它增強了T細胞與APCs或靶細胞之間的黏附，并促進T細胞對抗原的識別。其細胞質(zhì)域可以與多種酪氨酸激酶結(jié)合，介導(dǎo)信號傳導(dǎo)。
4.2.2 CD3
CD3與TCR跨膜區(qū)結(jié)合形成穩(wěn)定的TCR-CD3復(fù)合物。在這個復(fù)合物中，TCR負責(zé)識別抗原肽-MHC分子復(fù)合物，而CD3分子負責(zé)將激活信號傳導(dǎo)到細胞內(nèi)。
CD3分子的細胞質(zhì)域含有與免疫細胞激活信號轉(zhuǎn)導(dǎo)有關(guān)的免疫受體酪氨酸激活基序（ITAM），表明它參與免疫細胞的激活。
4.2.3 CD4
CD4是T輔助細胞的標(biāo)記，是一種單鏈跨膜蛋白。其細胞外結(jié)構(gòu)屬于IgSF，有四個IgSF結(jié)構(gòu)域。第一和第二結(jié)構(gòu)域可以與MHCII類分子結(jié)合。CD4作為TCR-CD3復(fù)合物識別抗原的輔助受體，通過與MHCII分子、p56lek激酶結(jié)合，參與信號傳導(dǎo)。
4.2.4 CD8
CD8是細胞毒性T細胞的標(biāo)記，是由α鏈和β鏈通過二硫鍵連接形成的異二聚體，其細胞外結(jié)構(gòu)是IgSF成員。CD8分子的細胞質(zhì)區(qū)域可以與p56lek激酶結(jié)合，參與信號傳導(dǎo)。CD8+T淋巴細胞能夠特異性地殺傷靶細胞，具有抗腫瘤、抗病毒和重要的免疫調(diào)節(jié)作用，其主要功能是抑制免疫應(yīng)答 [15]。
CD4和CD8分子將T細胞分為兩個明顯的亞群。CD4和CD8分別是MHCII類或MHCI類分子的受體，CD4+和CD8+細胞數(shù)量和比例的變化反映了機體的免疫功能狀態(tài)。
圖2. CD4和CD8編譯器的結(jié)構(gòu)
4.2.5 CD28 和 CTLA-4（CD152）
它們是經(jīng)典的共刺激分子。在結(jié)構(gòu)上，兩者高度同源，由兩個多肽鏈連接形成同源二聚體。
CD28：在幾乎所有CD4+ T細胞中表達，50%的CD8+ T細胞中表達。漿細胞和部分活化的B細胞也表達CD28。
CTLA-4：僅在活化的T細胞上表達。
CD28和CTLA-4的天然配體是B7（CD80/CD86）。
CD28-B7（CD80/CD86）提供了T細胞激活的第二信號（共刺激信號）。
CTLA-4-B7（CD80/CD86）提供了激活的T細胞抑制信號。
4.2.6 CD40L（CD154）
它屬于Ⅱ型跨膜蛋白，主要在CD4+ T細胞和CD8+ T細胞表面的激活中表達。CD40L與B細胞表面的CD40相互作用，提供協(xié)同刺激信號，促進B細胞增殖、分化、抗體合成和依賴于胸腺抗原（TD-Ag）的免疫應(yīng)答。
4.2.7 病毒受體
通過這些受體，病毒可以選擇性地感染T細胞的一個子群。例如，HIV可以通過感染輔助T細胞（CD4+細胞）來引發(fā)艾滋病。
4.2.8 其他表面標(biāo)志物
包括白細胞介素受體、整合素受體、轉(zhuǎn)鐵蛋白受體等。
5. B淋巴細胞及其細胞表面標(biāo)志物
5.1 B淋巴細胞
B細胞是來源于造血組織的特異性抗原淋巴細胞。與T細胞不同，B細胞在骨髓中分化和成熟。受抗原刺激后，B淋巴細胞首先轉(zhuǎn)化為漿母細胞，然后分化為漿細胞，產(chǎn)生和分泌免疫球蛋白（抗體），參與體液免疫。其功能包括產(chǎn)生抗體、呈遞抗原，以及分泌參與免疫調(diào)節(jié)的細胞因子 [16]。B細胞及其亞群的檢測是研究自身免疫疾病和疾病中的免疫調(diào)節(jié)紊亂的重要指標(biāo)。
5.2 B細胞表面標(biāo)志物
5.2.1 B細胞抗原受體，BCR / 表面膜免疫球蛋白，SmIg
它是嵌入在細胞膜脂質(zhì)分子中的免疫球蛋白，在成熟的B細胞和大多數(shù)B細胞腫瘤細胞中表達。成熟的B細胞主要表達mIgM和mIgD，其含量也反映了細胞成熟的程度：IgM > IgD較為不成熟，IgD > IgM較為成熟。
BCR是B細胞最具特征性的表面標(biāo)志物。它可以特異性地結(jié)合相應(yīng)的抗原，也可以特異性地結(jié)合抗免疫球蛋白抗體。
5.2.2 補體受體（CR）
成熟的B細胞表面表達補體受體，主要是C3受體。
補體受體1（CR1），也稱為C3b受體或C3b / C4b受體，與C3b和C4b結(jié)合，促進B細胞激活。
補體受體2（CD21），B細胞的一個重要標(biāo)記，也稱為C3d受體，同時也是Epstein-Barr病毒的受體。
5.2.3 分化抗原
CD19，CD20，CD21和CD40通常用于B細胞功能分析。
此外，還包括有絲分裂原受體、Fc受體、MHC抗原等表面標(biāo)志物。
6. 自然殺傷細胞及其細胞表面標(biāo)志物
6.1 自然殺傷細胞
自然殺傷細胞是胞漿中含有大顆粒的細胞。NK細胞的確切來源尚不明確，一般認為直接來源于骨髓。激活的NK細胞通過分泌細胞因子和細胞毒性 [19]發(fā)揮抗病毒 [17]、抗腫瘤 [18]和免疫調(diào)節(jié)作用。
6.2 NK細胞表面標(biāo)志物
目前，CD3-CD16+CD56+通常被用作其典型標(biāo)志。
CD16（FcγRIII），CD56（NCAM-1），CD94，CD158（KIR）和CD161（NKR-P1A）通常用于NK細胞功能分析。
綜上所述，淋巴細胞亞群可以通過細胞表面標(biāo)志物進行區(qū)分，見表2。
表2. T、B、NK細胞表面標(biāo)志物物比較
| 表面標(biāo)志物 | T 細胞 | B 細胞 | NK 細胞 |
|---|---|---|---|
| 膜表面免疫球蛋白(SmIg) | － | ＋ | － |
| TCR | ＋ | － | － |
| CD2 | ＋ | － | ＋ |
| CD3 | ＋ | － | － |
| CD19, CD20 | － | ＋ | － |
| CD16, CD56 | － | － | ＋ |
| 補體受體 (CR) | － | ＋ | part |
| Fc 受體 | － | ＋ | ＋ |
圖3. T淋巴細胞、B淋巴細胞和自然殺傷細胞的細胞表面標(biāo)志物
7. 淋巴細胞的檢測
7.1 免疫熒光法
免疫熒光法包括間接免疫熒光法和直接免疫熒光法。
間接免疫熒光法的過程：首先，待檢測的細胞經(jīng)過無標(biāo)記抗體處理，與特定抗原形成復(fù)合物，然后使用熒光標(biāo)記的抗抗體來檢測細胞中特定抗原的存在，從而產(chǎn)生熒光增強效應(yīng)。
B細胞表面標(biāo)志物-SmIg可以通過間接免疫熒光法進行檢測。
這種方法的特點具有很強的特異性，可以通過顯微鏡觀察準(zhǔn)確地確定組織或細胞中熒光的分布情況。
圖4. 間接免疫熒光和直接免疫熒光技術(shù)
7.2 免疫細胞化學(xué)
該方法通常采用酶聯(lián)免疫測定，如生物素-鏈霉素系統(tǒng)。通過顯微鏡，表現(xiàn)為棕黃色的細胞被判定為CD抗原陽性細胞。
7.3 紅細胞花環(huán)試驗
將用相應(yīng)抗體標(biāo)記的紅細胞作為指示物，與待檢測的細胞混合。
羊紅細胞（SRBC）與人類淋巴細胞（E花環(huán)）自發(fā)形成花環(huán) [20] [21]。因此，可以用于檢測T細胞上的SRBC受體。這種方法的原理是利用T細胞表面的SRBC受體與SRBC形成花環(huán)。
該方法簡單，試劑相對便宜。這是一種經(jīng)典的T淋巴細胞檢測方法。但其缺點是結(jié)果不太穩(wěn)定，受個人主觀影響。
8. 淋巴細胞表面標(biāo)志物的應(yīng)用
淋巴細胞亞群的分析可以揭示患者免疫功能的平衡情況。
8.1 在腫瘤疾病中的應(yīng)用
機體的免疫功能與惡性腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。
腫瘤患者外周血的T淋巴細胞亞群異常?；颊叩腃D3+細胞和CD4+細胞顯著減少，而CD8+細胞顯著增加。這種免疫抑制狀態(tài)降低了患者識別和殺傷突變細胞的能力。
8.2 在自身免疫性疾病中的應(yīng)用
自身免疫性疾病患者的淋巴細胞亞群通常受到干擾。淋巴細胞比例的變化與自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān) [22]。
CD4+/CD8+比率的增加會導(dǎo)致自身免疫疾病 [23]。
淋巴細胞表面標(biāo)志物還可以用于研究淋巴細胞分化的過程和功能。不同淋巴細胞群體的數(shù)量和功能的變化也可能與各種疾病的發(fā)生有關(guān)。例如，艾滋病患者的CD4+T細胞顯著減少甚至缺失。
因此，檢測淋巴細胞亞群在控制某些疾病的發(fā)生和發(fā)展、了解發(fā)病機制以及指導(dǎo)臨床治療方面具有重要意義。
參考文獻：
[1] Niu J, Chang Y, Lu X, et al. Effect of dendritic cell vaccine therapy on lymphocyte subpopulation in refractory primary brain tumor [J]. Indian J Cancer, 2016, 52(4): 587 -589.
[2] Hsieh CT, Luo YH, Chien CS, et al. Induced pluripotent stem cellconditioned medium suppressed melanoma tumorigenicity through the enhancement of Natural-Killer cellular immunity [J]. J Immunother, 2016, 39(4): 153-159.
[3] Lisse I M, Qureshi K, Poulsen A, et al. T-lymphocyte subsets and eosinophil counts in acute and convalescence chickenpox infection: a household study in Guinea- Bissau [J]. Journal of Infection, 2005, 50(2): 125-129.
[4] Yushchuk N D, Gadzhikulieva M M, Balmasova I P, et al. The role of immune factors in the progression of chronic kidney diseases in HIV infection [J]. Ter Arkh, 2015, 88(3): 56-61.
[5] Bravo Soto JA, Esteban De La Rosa RJ, Luna Del Castillo JD, et al. Effect of mycophenolate mofetil regimen on peripheral blood lymphocyte subsets in kidney transplant recipients [J]. Transplant Proc, 2003, 35(4): 1355-1359.
[6] Cho JH, Yoon YD, Jang HM, et al. Immunologic monitoring of T-Lymphocyte subsets and Hla-Dr-Positive monocytes in kidney transplant recipients: a prospective, observational cohort study [J]. Medicine (Baltimore), 2015, 94(44): e1902.
[7] Papamichail M. T and B Lymphocytes: Origins, Properties and Roles in Immune Responses [J]. Immunology, 1975, 28(1).
[8] Yasutomo K. The cellular and molecular mechanism of CD4/CD8 lineage commitment [J]. Journal of Medical Investigation Jmi, 2002, 49(1-2): 1.
[9] Godfrey D I, Macdonald H R, Kronenberg M, et al. NKT cells: what's in a name? [J]. Nature Reviews Immunology, 2004, 4(3): 231-237.
[10] Yamaguchi Y, Ohshita A, Kawabuchi Y, et al. Adoptive immunotherapy of cancer using activated Autologous lymphocytes-current status and new strategies [J]. Human Cell, 2010, 16(4): 183-189.
[11] Brigl M, Brenner M B. CD1: Antigen Presentation and T Cell Function [J]. Annual Review of Immunology, 2004, 22(1): 817-890.
[12] Rogge L, Barberis - Manino L, Biffi M, et al. Selective expression of an IL - 12 receptor component by human T helper 1 cells [J]. J Exp Med, 1997 , 185: 825-831.
[13] Xu D,Chan WL,Leung BP, et al. Selective expression and functions of IL - 18 recptor on T helper (Th) type 1 but not Th2 cells [J ]. J Exp Med,1998 ,188 (8): 1485-1492.
[14] Mosmann TR, Cherwinski H, BondMW, et al. Two types of murine helper T cell clone. I. Defination according to profiles of lymphokine activities and secreated proteins [J]. J Immunol, 1986 , 136: 2348-2357.
[15] Appay V, Lier R A W V, Sallusto F, et al. Phenotype and function of human T lymphocyte subsets: Consensus and issues [J]. Cytometry, 2008, 73A(11): 975-983.
[16] Yu Q M, Yu C D, Ling Z Q. Elevated Circulating CD19(+) Lymphocytes Predict Survival Advantage in Patients with Gastric Cancer [J]. Asian Pacific journal of cancer prevention, 2012, 13(5): 2219-2224.
[17] Aura M, Marcel C G, Andrea V, et al. Priming of NK Cell Anti-Viral Effector Mechanisms by Direct Recognition of Human Cytomegalovirus [J]. Frontiers in Immunology, 2013, 0-4.
[18] Krzywinska E, Allende-Vega N, Cornillon A, et al. Identification of Anti-tumor Cells Carrying Natural Killer (NK) Cell Antigens in Patients With Hematological Cancers [J]. EBioMedicine, 2015, 2(10): 1364-1376.
[19] Galazka G, Jurewicz A, Domowicz M, et al. HINT1 peptide/Hsp70 complex induces NK-cell-dependent immunoregulation in a model of autoimmune demyelination [J]. Eur J Immunol, 2014, 44(10): 3026-3044.
[20] Lay W H, Mendes N F, Bianco C, et al. Binding of sheep red blood cells to a large population of human lymphocytes [J]. Nature, 1971, 230(5295): 531-2.
[21] Brain P, Gordon J. Rosette formation by peripheral lymphocytes. II. Inhibition of the phenomenon [J]. Clinical & Experimental Immunology, 1971, 8(3): 441-9.
[22] Gopalakrishnan S, Sen S, Adhikari J S, et al. The role of T-lymphocyte subsets and interleukin-5 blood levels among Indian subjects with autoimmune thyroid disease [J]. Hormones (Athens, Greece), 2010, 9(1): 76-81.
[23] Harrington L E, Hatton R D, Mangan P R, et al. Interleukin 17–producing CD4+ effector T cells develop via a lineage distinct from the T helper type 1 and 2 lineages [J]. Nature Immunology, 2005, 6(11): 1123-1132.
