1、NKG2D的結(jié)構(gòu)和功能

NKG2D基因位于NK基因復(fù)合體（NKC）中，是1991年在篩選人類NK細(xì)胞的優(yōu)勢(shì)表達(dá)基因時(shí)發(fā)現(xiàn)的，同時(shí)篩選出的還有相鄰的NKG2A、NKG2C和NKG2E。NKG2基因編碼的分子全部表達(dá)在細(xì)胞膜上，屬II型跨膜受體，序列與C型凝集素相似。NKG2D基因位于人染色體12p12-12p13或小鼠4號(hào)染色體NK復(fù)合體中（圖一）^[1]。

Figure 1. Chromosome localization of NKG2D

*This diagram is derived from reference 1.

NKG2D蛋白是由KLRK1基因編碼的42 KDa蛋白，具有功能性單核苷酸多態(tài)性（SNPs）^[2]。KLRK1基因長(zhǎng)度為37793個(gè)堿基，位于12號(hào)染色體負(fù)鏈的10416219-10454012 bp處。ENTREZ數(shù)據(jù)庫(kù)的數(shù)據(jù)顯示，它包含12個(gè)外顯子。在人KLRK1的三個(gè)等位基因中發(fā)現(xiàn)了兩個(gè)核苷酸位點(diǎn)的同義和非同義替換，這可能是有限多態(tài)性。同源基因KLRK1的有限多態(tài)性在小鼠中也已被證實(shí)。KLRK1的同源基因存在于哺乳動(dòng)物和有袋動(dòng)物的所有基因組中，在進(jìn)化過(guò)程中高度保守（圖2）。作為一種活性受體，NKG2D可以在人類和小鼠的NK細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞和其他免疫活性細(xì)胞中表達(dá)，但在CD4+T細(xì)胞中通常不表達(dá)^[3]。

Figure 2. The gene structure of human NKG2D

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2、NKG2D的配體

與其他NKG2受體不同，NKG2D擁有多種配體，包括人類MHC-I類鏈相關(guān)分子（MICA和MICB）和人類UL16結(jié)合蛋白（ULBPs，也稱為人類RAET1）。NKG2D配體大都為多片段組成的跨膜蛋白，但也有部分RAET1蛋白缺乏跨膜結(jié)構(gòu)，他們通過(guò)糖基磷脂酰肌醇錨固在細(xì)胞膜上。

2.1人類MHC-I類鏈相關(guān)分子

人類MHC-I類鏈相關(guān)分子（MIC）位于人類6號(hào)染色體短臂上MHC I類基因區(qū)，目前認(rèn)為在MIC基因7個(gè)成員（MICA-MICG）中MICA和MICB能夠被轉(zhuǎn)錄，而MICC、MICD、MICE和MICG 4個(gè)基因均為假基因。MICA和MICB編碼區(qū)有90%以上的同源序列。MIC分子有a1、a2和a3三個(gè)胞外結(jié)構(gòu)域，一個(gè)跨膜區(qū)和一個(gè)羧基胞質(zhì)區(qū)。與經(jīng)典MHCI類分子明顯不同的是，MIC分子不與β2微球蛋白結(jié)合。在正常人體內(nèi)MIC分布僅局限于胃腸道上皮、內(nèi)皮細(xì)胞以及成纖維細(xì)胞。在感染、腫瘤以及器官移植受體組織細(xì)胞中都有MIC的表達(dá)。已有研究證實(shí)許多上皮來(lái)源的腫瘤，比如乳腺癌、肺癌、卵巢癌、結(jié)腸癌、神經(jīng)膠質(zhì)瘤以及黑色素瘤中都有MIC的產(chǎn)生，MIC被認(rèn)為是一種腫瘤相關(guān)性抗原 ^{[4] [5]}。

2.2 人類UL16結(jié)合蛋白

UL16蛋白是人巨細(xì)胞病毒感染細(xì)胞表達(dá)的一種跨膜糖蛋白，Cosman等利用UL16-Fc融合蛋白發(fā)現(xiàn)了兩種結(jié)合UL16蛋白，命名為ULBP1和ULBP2 ^[6]。ULBP是一類人類細(xì)胞表面分子，目前已發(fā)現(xiàn)四個(gè)ULBP，不同ULBP分子有50% ~ 60%的相同氨基酸序列，與MIC和MHC-I類分子之間有大約25%的序列同源。ULBP結(jié)構(gòu)均帶有MHC I類分子樣a1、a2結(jié)構(gòu)域，但缺乏免疫球蛋白樣a3結(jié)構(gòu)域，同樣也不與β2微球蛋白結(jié)合。ULBP1、ULBP2和ULBP3是GPI連接蛋白，而ULBP4則是跨膜蛋白 ^{[7] [8] [9]}。與MIC相比，ULBP表達(dá)更為廣泛，在多種正常組織及腫瘤均有表達(dá)。ULBP在病毒感染及人類巨細(xì)胞病毒逃脫免疫監(jiān)視過(guò)程中起重要作用 ^[10].

3、NKG2D信號(hào)傳導(dǎo)

NKG2D不是典型的NKC2家族成員，與其他成員（NKG2A、NKG2C和NKG2E）只有21%的同源性，結(jié)構(gòu)和功能都存在明顯差異。NKG2A、NKG2C以及NKG2E分子的蛋白序列極為相似，它們?cè)诩?xì)胞表面與CD94分子形成異二聚體，通過(guò)識(shí)別 “缺失性自我”(missing self)，即對(duì)自身主要組織相容性復(fù)合體MHC-I類分子的“識(shí)別”，介導(dǎo)NK細(xì)胞的殺傷活性。NKG2D不與CD94結(jié)合，而是自身形成同源二聚體表達(dá)于細(xì)胞表面。另外，NKG2D信號(hào)傳導(dǎo)方式也有差異，其胞漿區(qū)不具信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)功能，跨膜區(qū)與轉(zhuǎn)接蛋白DAP10同源二聚體結(jié)合。NKG2D作為一種重要的激活受體，可以通過(guò)誘導(dǎo)契合理論特異性結(jié)合DAP10，進(jìn)而誘導(dǎo)磷酸化^[11]。DAP10不含免疫受體酪氨酸活化基序ITAM，而是含有-YxxM基序。NKG2D與配體結(jié)合后，NKG2D同源二聚體跨膜區(qū)域的帶電氨基酸殘基通過(guò)兩個(gè)鹽橋連接到DAP10的TM殘基上，形成六聚體結(jié)構(gòu)（圖3），繼而誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中YxxM 基序的磷酸化，然后激活下游磷酸肌醇3激酶(PI3K)信號(hào)通路，傳遞活化信號(hào)。NKG2D產(chǎn)生的信號(hào)可直接激活NK細(xì)胞發(fā)揮殺傷效應(yīng)，并作為協(xié)同刺激信號(hào)促進(jìn)αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞的活化并增強(qiáng)其殺傷效應(yīng)。

Figure 3. The interaction between NKG2D and its ligands

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自1997年全球首款抗CD20單抗——羅氏的利妥昔單抗獲批以來(lái)，全球已經(jīng)批準(zhǔn)多款抗CD20單抗。根據(jù)人源化程度以及Fc片段修飾，抗CD20單抗可分為三代，其中第一代是以利妥昔單抗為代表的嵌合或者鼠源單抗，第二代是以?shī)W法木單抗為代表的人源化單抗，第三代的抗CD20單抗以?shī)W妥珠單抗為代表，其抗體的Fc片段經(jīng)過(guò)了糖基化修飾。

4、NKG2D/ NKG2DL與腫瘤免疫

從第三部分NKG2D傳導(dǎo)可以發(fā)現(xiàn)，NKG2D的生物學(xué)功能與其配體息息相關(guān)。在這部分中，我們重點(diǎn)闡明了NKG2D及其配體在腫瘤免疫中的作用。

• NKG2D/ NKG2DL可以介導(dǎo)免疫細(xì)胞的腫瘤殺傷作用。這種殺傷作用是由多種免疫細(xì)胞及免疫因子共同參與實(shí)現(xiàn)的。NK細(xì)胞具有搜尋“缺乏自我”細(xì)胞的功能，是機(jī)體免疫系統(tǒng)免疫監(jiān)視及抑制腫瘤生長(zhǎng)第一道防線，無(wú)需抗原刺激即可殺傷腫瘤細(xì)胞 ^[12]。腫瘤細(xì)胞的表面MHCI類分子產(chǎn)生減少，因此其不能被抑制性受體識(shí)別，無(wú)法傳導(dǎo)負(fù)調(diào)節(jié)信號(hào)，致使NK細(xì)胞處于激活狀態(tài)而殺傷上述靶細(xì)胞。然而部分腫瘤細(xì)胞即使表達(dá)MHCI類分子，仍可被NK細(xì)胞識(shí)別，這是因?yàn)槠渫瑫r(shí)表達(dá)NKG2D配體，激活NK細(xì)胞“識(shí)別異我”功能，防止腫瘤細(xì)胞免疫逃逸。除了NK細(xì)胞外，NKG2D受體也可表達(dá)于多種T細(xì)胞表面，根據(jù)TCR的不同，T細(xì)胞可分為αβT細(xì)胞和γδT細(xì)胞。以肺癌為例，肺組織中主要分布的為γδT細(xì)胞，NKG2D幾乎可表達(dá)于全部的γδT細(xì)胞的細(xì)胞膜表面。而γδT細(xì)胞可直接識(shí)別肺癌細(xì)胞表面的MICA、MICB等NKG2DL，并與之結(jié)合，進(jìn)而誘導(dǎo)強(qiáng)烈的細(xì)胞毒性作用殺傷表達(dá)NKG2DL的肺癌細(xì)胞。
• NKG2D配體在腫瘤細(xì)胞中的免疫監(jiān)督作用。早期Bauer等報(bào)道腫瘤細(xì)胞在表達(dá)NKC2D配體MIC-A后，通過(guò)NKC2D能夠有效地被清除。小鼠NK細(xì)胞也能有效的清除被轉(zhuǎn)染H60或者RAE-1的RMA細(xì)胞。還有報(bào)道骨髓瘤細(xì)胞系在表達(dá)NKC2D配體后，NK細(xì)胞通過(guò)NKC2D能夠識(shí)別這些配體并排斥骨髓瘤細(xì)胞。眾所周知，DNA損傷在許多腫瘤中被激活。DNA損傷的激活可以認(rèn)為是腫瘤細(xì)胞和免疫細(xì)胞之間的傳感器。DNA損傷能夠誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞在細(xì)胞表面表達(dá)NKC2D配體。這些腫瘤細(xì)胞能夠被具有NKC2D的免疫細(xì)胞標(biāo)記為可殺傷細(xì)胞。在傳統(tǒng)的化療和放療過(guò)程中DNA的損傷常常誘導(dǎo)NKC2D配體的產(chǎn)生從而激發(fā)免疫細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞引起免疫應(yīng)答。有人報(bào)道使腫瘤相關(guān)抗原特異性抗體的Fab片段與重組的MIC-A相結(jié)合,在抗體識(shí)別腫瘤相關(guān)抗原后，可使MIC-A包被整個(gè)腫瘤細(xì)胞。MIC-A包被的腫瘤細(xì)胞易于被NK細(xì)胞識(shí)別并裂解^[13]。2008年，SongH等發(fā)現(xiàn)IL-18可以在mRNA和蛋白質(zhì)水平提高白血病細(xì)胞ULBP2的表達(dá)，通過(guò)磷酸化ERKY2和JNKMAPK信號(hào)通路來(lái)增強(qiáng)NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷作用 ^[14]。

5、NKG2D臨床研究

目前以NKG2D為靶點(diǎn)的在研藥物/療法主要集中在臨床早期，作用機(jī)制以CAR-T/CAR-NK為主，適應(yīng)癥以血液瘤為主。從目前臨床研究成果來(lái)看，CAR-T療法比較多，截至目前，全球有11種針對(duì)NKG2D的在研藥物，其中以CAR-T細(xì)胞療法為作用機(jī)制的就有10種。而CAR-NK療法因?yàn)闆](méi)有發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子釋放綜合癥及神經(jīng)毒性等副作用，因而比CAR-T療法具有優(yōu)勢(shì)，這可能是由于NK細(xì)胞本身不容易導(dǎo)致過(guò)高的細(xì)胞因子分泌。除此之外CAR-NK療法不需要以患者的自體免疫細(xì)胞作為來(lái)源、治療成本更低等優(yōu)勢(shì)可能使它成為CAR-T療法的一大競(jìng)爭(zhēng)對(duì)手。除抗腫瘤藥物外，強(qiáng)生旗下的楊森公司針對(duì)該靶點(diǎn)在自身免疫疾病方面的作用開發(fā)了一款單抗類藥物，通過(guò)抑制該靶點(diǎn)活性來(lái)降低克羅恩病患者的炎癥反應(yīng)。

6、NKG2D相關(guān)產(chǎn)品

Recombinant Human NKG2-D type II integral membrane protein (KLRK1), partial (Active) (CSB-MP012474HU1)

Recombinant Human UL16-binding protein 1(ULBP1) (Active) (CSB-MP887177HU)

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